免疫组化（IHC）

产品介绍：

免疫组化，是应用免疫学基本原理 ——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术 (immunohistochemistry) 或免疫细胞化学技术 (immunocytochemistry) 。

 

 

实验步骤：

1、  石蜡切片脱蜡至水： 依次将切片放入二甲苯 Ⅰ 15 min- 二甲苯 Ⅱ 15 min- 无水乙醇 Ⅰ 5 min- 无水乙醇 Ⅱ 5 min- 8 5% 酒精 5min- 75 % 酒精 5min- 蒸馏水洗。

2、  抗原修复： 组织切片置于盛满 合适的修复液 的 修复盒中于微波炉内进行抗原修复，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。 自然冷却后将玻片置于 PBS （ PH7.4） 中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min 。

3、  阻断内源性过氧化物酶： 切片放入 3%过氧化氢溶液，室温 避光 孵育 2 5  min ， 将玻片置于 PBS （ PH7.4） 中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min 。

4、  BSA 或者血清封闭 : 切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加 用 3 %BSA 均匀覆盖组织，室温封闭 30min 。

5、  加一抗： 轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加 PBS 按一定比例配好的一抗， 切片平放于湿盒内 4°C 孵育过夜。 （湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

6、  加二抗： 玻片置于 PBS （ PH7.4） 中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min 。切片稍甩干后在圈内滴加组化试剂盒内与一抗相应种属的二抗（ HRP 标记）覆盖组织，室温孵育 50min 。

7、  DAB 显色： 玻片置于 PBS （ PH7.4） 中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min 。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的 DAB 显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。

8、  复染细胞核： Harris 苏木素复染 3min 左右，自来水洗， 1% 的盐酸酒精分化数秒， 自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。

9、  脱水封片： 将切片依次放入 7 5 % 酒精 6 min- 8 5 % 酒精 6 min -- 无水乙醇 Ⅰ 6 min - 无水乙醇 Ⅱ 6 min - 二甲苯 Ⅰ 5min  中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

10、  显微镜镜检，图像采集分析。

注意事项：

1） 石蜡切片制片，组织取样后应立即放入固定液中，避免冻存；

2） 冰冻切片制片应取用新鲜组织，以免抗原丢失；

3） 组织蜡块可以保存很长时间，但是石蜡切片理论上不能超过半年，冰冻切片不能超过 3 个月。